Молекулярные переключатели чрезвычайно малы, но тонко устроены. Например, линейные размеры АТФ-аптамера в растворе существенно меньше 10 нм. Поэтому для всестороннего изучения таких объектов необходимо владеть большим количеством изощрённых методик. Для разработки и изучения наших объектов мы применяем следующие современные подходы:
Спектрофотометрия поглощения в УФ
Спектрофотометрия является одним из самых простых аналитических методов. В простейшем случае она позволяет определять концентрации растворов наночастиц, ДНК или белков. Но применимость этого метода определением концентраций не ограничивается. Например, для раствора ДНК известной концентрации он позволяет вычислить долю гибридизованных оснований во всей молекуле. В лаборатории имеется несколько спектрофотометров СФ-56 и СФ-2000 для рутинных измерений. Для постановки классических экспериментов по фотометрическому плавлению ДНК мы используем двулучевой спектрофотометр Specord 200.
Люминесцентная спектрофотометрия
Анализ флюоресценции аптамеров или пришитых к ним специальных меток позволяет с высочайшей детализацией определять пространственное и функциональное состояние молекулярных машин. Флюориметр Hitachi F-7000 может детектировать даже десятки наномоль флуоресцирующего вещества. Зависимость флюоресценции от температуры может быть использована для построения термодинамической модели систем. 7500 Real Time PCR System позволяет в течение пары часов получать немногим меньше 100 кривых плавления, что открывает широкие возможности для исследования большого количества разных вариантов аптамеров одновременно.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ)
Мы обладаем широкими компетенциями в области микроскопии нанообъектов, как в пробоподготовке и проведении измерений на современном мискроскопе Bruker MultiMode 8, так и анализе результатов. Ведущий исследователь лаборатории Пётр Соколов, читает специализированный курс “Микроскопия нанообъектов”, в котором рассказывает об АСМ и многих других видах микроскопов.
Дизайн нуклеотидных последовательностей
Отбор удачных вариантов молекулярных систем из множества случайных прототипов не всегда рационален с точки зрения затрат времени и труда. Хорошо зарекомендовал себя подход рационального дизайна (rational design, хороший пример см. в работе 10.1038/s41467-020-16808-2). Различные программы (например, NuPACK или mfold) позволяют грубо моделировать конформации и топологию молекулярных машин, что существенно сужает область поиска систем с желаемыми свойствами. Ведущий исследователь лаборатории Пётр Соколов читает курс “Статистика макромолекул”, который будет особенно интересен студентам, склонным к теоретическим расчётам.
Электрофорез в агарозе и ПААГ
Многие из исследуемых нами молекул и частиц имеют ненулевой заряд при определенных значениях pH буфера. Это значит, что приложив к ним электрическое поле, можно “просеивать” их через заранее приготовленный гель. Большие и тяжелые частицы двигаются через гель медленнее, маленькие и лёгкие – быстрее, что позволяет разделять сложные многокомпонентные смеси молекул на отдельные составляющие. В нашем распоряжении есть оборудование для двух самых распространенных видов электрофореза – горизонтального ЭФ в агарозном геле и вертикального ЭФ в полиакриламидном геле.
Динамическое рассеяние света (ДРС)
Изучая упруго рассеяный молекулами и частицами свет, можно получить уникальную информацию о гидродинамическом радиусе исследуемых объектов и даже, в ряде случаев, об их форме. К примеру, работа биосенсора, работающего по принципу агрегации его компонентов при связывании с мишенью может быть легко изучена данным методом.
Поверхностный плазмонный резонанс (ППР)
ППР являтеся одним из наиболее распространненых методов изучения взаимодейсвтия молекул, к примеру, патогенов и антител и, аналогично, аптамеров и их мишеней. В нашей лаборатории мы применям модифицированные тиолом аптамеры, закрепляя их на поверхности чипа с золотым напылением. При прокачивании «над» чипом растворов с мишенями, часть из них связывается с аптамерами, что вызывает изменение сигнала ППР. Взаимодействие молекул можно наблюдать почти в реальном времени.
Общелабораторные практики
- pH-метрия
- Приготовления буферных растворов
- Работа с растворами белков и ДНК
Методики на базе Ресурсных Центров СПбГУ
Как часть Университета, мы имеем доступ к широкому спектру совеременного оборудования Ресурсных Центров СПбГУ. Наша лаборатория приветствует инициативное освоение новых для лаборатории методик студентами.
Учась у нас, вы можете получить навыки и знания, необходимые для уверенного старта карьеры учёного или сотрудника одной из ведущих российских или зарубежных biotech компаний. Мы приветствуем свободный обмен опытом и знаниями между студентами младших курсов, аспирантами и преподавательским составом в нашей лаборатории.